カビによる肝障害悪化メカニズムを解明

要点

理化学研究所（理研）ライフサイエンス技術基盤研究センター微量シグナル制御技術開発特別ユニットの小嶋聡一特別ユニットリーダー、ロナク・シュレスタ国際プログラム・アソシエイト（研究当時）と、加藤分子物性研究室の大島勇吾専任研究員、東京工業大学生命理工学院の梶原将教授らの共同研究グループは、肝臓に侵入した真菌（カビ）が活性酸素^[用語1-1]、特にヒドロキシルラジカル^[用語1-2]を作り、その酸化ストレス^[用語2]を介して肝細胞死を引き起こす分子メカニズムを明らかにしました。

日本における肝がん（肝臓がん）の主な原因は、肝炎ウイルスの感染（いわゆるウイルス性肝炎）ですが、欧米ではアルコールの過剰摂取によるアルコール性脂肪性肝炎（ASH）^[用語3-1]が大きなウエイトを占めています。さらに、近い将来には世界的にメタボリックシンドローム^[用語4]の肝臓での表現型である非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）^[用語3-2] が主な原因になるといわれています^注1。ASH/NASH患者においては、腸内に生息する病原性真菌の一種カンジダ菌が肝臓に到達することが報告されています^注2。小嶋特別ユニットリーダーらの先行研究から、ASH/NASH患者の肝細胞では、通常は細胞質に存在するタンパク質架橋酵素「トランスグルタミナーゼ（TG2）^[用語5]」が細胞核に局在することで肝細胞死を引き起こし、肝障害を悪化（増悪）させることが判明しています^注3。しかし、肝臓に到達したカンジダ菌がこの病態形成機構に及ぼす影響は分かっていませんでした。

今回、共同研究グループは、病原性カンジダ菌と非病原性の酵母菌を、肝細胞と共培養しました。その結果、カンジダ菌は活性酸素、特にヒドロキシルラジカルを産生し、これを介して肝細胞におけるTG2の核局在と活性促進を招き、肝細胞死を引き起こすことが分かりました。同様の結果は、カンジダ菌を感染させたマウスの肝細胞においても観察されました。

今回の発見は、ASH/NASHの患者において観察される肝障害の新たな発症機構と想定されます。今後、TG2の核局在を標的とした肝障害を抑える新しい薬剤の開発につながる可能性があります。

本研究成果は、英国の科学雑誌『Scientific Reports』のオンライン版（7月6日付け：日本時間7月7日）に掲載されました。

1. 注1日本肝臓学会「肝がん白書 平成27年版」
2. 注2Yang A-M, Inamine T, Hochrath K, Chen P, Wang L, Llorente C, Bluemel S, Hartmann P, Xu J, Koyama Y, Kisseleva T, Torralba MG, Mncera K, Beeri K, Chen C-S, Freese K, Hellerbrand C, Lee SML, Hoffman HM, Mehal WZ, Garcia-Tsao G, Mutlu EA, Keshavarzian A, Brown GD, Ho SB, Bataller R, Stärkel P, Fouts DE, Schnabl B; Intestinal "fungi contribute to development of alcoholic liver disease.", J Clin Invest 2017 Jun 30;127(7):2829-2841.
3. 注32009年5月1日プレスリリース「タンパク質の架橋反応が細胞死を招き、アルコール性肝障害に」

共同研究グループ

理化学研究所

ライフサイエンス技術基盤研究センター 生命機能動的イメージング部門
イメージング応用研究グループ 微量シグナル制御技術開発特別ユニット

加藤分子物性研究室

• 専任研究員 大島勇吾（おおしまゆうご）

東京工業大学 生命理工学院

• 教授 梶原将（かじわらすすむ）

千葉大学真菌医学研究センター

• 准教授 知花博治（ちばなひろじ）

中国食品発酵工業研究院

• 院長 蔡木易（さいもくい）
• 主任研究員 魯軍（ろくん）

研究の背景

現在、日本における肝がん（肝臓がん）の主な原因は、肝炎ウイルスの感染（いわゆるウイルス性肝炎）ですが、欧米ではアルコールの過剰摂取によるアルコール性脂肪性肝炎（ASH）が大きなウエイトを占めています。さらに近い将来は、世界的にメタボリックシンドロームの肝臓での表現型である非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）が主な原因になるといわれています。ASHやNASHは、断酒や生活習慣の改善以外に有効な治療法は確立されておらず、その病態の解明や新薬の開発が課題となっています。

ASH/NASH患者においては、過度のアルコール摂取や遊離脂肪酸によって十二指腸のバリアがボロボロになり、腸内にいた真菌（カビ）や大腸菌が肝臓に到達することが報告されています。特に、病原性真菌の一種であるカンジダ菌が増えることが今年報告されました。2009年に小嶋特別ユニットリーダーらは、ASH/NASH患者の肝細胞では、通常は細胞質に存在するタンパク質架橋酵素トランスグルタミナーゼ（TG2）が細胞核に局在し、肝細胞の生存に必須の肝細胞増殖因子受容体c-Met^[用語6]の発現をつかさどる転写因子Sp1^[用語7]を過度に架橋結合^[用語8]させて不活性化することで、肝細胞死を引き起こし肝障害を悪化（増悪）させることを報告しています。しかし、肝臓に到達したカンジダ菌がこの病態形成機構に及ぼす影響については不明でした。

研究手法と成果

肝臓への真菌感染のモデルとして、病原性カンジダ菌（カンジダアルビカンス Candida albicans もしくはグラブラータ Candida glabrata）をヒト肝細胞株であるHc細胞と共培養し、経過を観察しました。共培養を開始して24時間後にはTG2の核局在と活性化が観察され、さらに、共培養開始から48時間後には細胞死が誘導されました（図1）。一方、病原性のないパン酵母とHc細胞との共培養では、これらの現象は起こりませんでした（図2）。

次に、カンジダ菌が何を介して肝細胞に作用しているかを調べるため、TG2核局在の誘導が起きるための条件検討を行いました。低分子のみを透過させる透析膜を隔てて共培養した場合でもTG2核局在の誘導はみられましたが、熱で殺菌処理した菌体や、菌の培養上清液を肝細胞に投与すると同様の現象は起こりませんでした。このことから、生きたカンジタ菌が産生する半減期の短い低分子が肝細胞に作用していると考えられました。

活性酸素は、TG2を活性化させる因子の一つとして知られており、これらの条件に合致します。そこでヒドロキシルラジカルの原料となる過酸化水素を肝細胞に投与したところ、カンジダ菌と共培養した場合と同様の作用があることが分かりました。さらに、カンジダ菌との共培養時に、活性酸素を捕捉する抗酸化剤であるN-アセチルシステインを投与するとTG2核局在の誘導はブロックされました（図1）。

ヒト肝細胞株Hc細胞の蛍光顕微鏡像。核はヘキスト（青）、活性化トランスグルタミナーゼはビオチン化基質5-（biotinamido）pentylamine（5BAPA）（緑）、細胞死の誘導はカスパーゼ活性（赤）の蛍光染色で観察した。Hc細胞をカンジダ菌と共培養すると、24時間後にTG2の発現誘導ならびに核局在（2段目2列目）、さらに48時間後にカスパーゼ3の誘導（2段目3列目）を伴う細胞死が観察された。このとき、抗活性酸素剤であるN-アセチルシステインを培養液中に添加して菌が産生する活性酸素をトラップすると、これらの変化を抑えることができた（3段目）。このことから、カンジダ菌が産生する活性酸素によって肝細胞においてTG2の発現と核局在が誘導され、肝細胞が細胞死に陥ることが示された。

ヒト肝細胞株Hc細胞とカンジダ菌を共培養すると、24時間後にTG2の発現誘導ならびに核局在（2段目2列目）、が誘導されるが、カンジダ菌と同数のパン酵母（出芽酵母）と共培養しても、そのような変化はみられなかった（3段目2列目）。

カンジダ菌が活性酸素を介して肝細胞に作用する可能性をさらに検証するため、肝細胞での活性酸素の局在を蛍光顕微鏡で観察し、共培養液中に存在する活性酸素種の同定を電子スピン共鳴（ESR）^[用語9]による解析で行いました。その結果、TG2核局在の誘導がみられる条件下でのみ活性酸素が核で顕著に検出され（図3）、そのときの培養液には活性酸素の一種ヒドロキシルラジカルが存在することが分かりました（図4）。このヒドロキシルラジカルがカンジタ菌に由来することは、ヒドロキシルラジカルを中心とした活性酸素の産生に働くNOX遺伝子^[用語10]を欠損させた変異菌では同様の現象を誘導できなかったことからも示されました（図3、図4）。さらに、カンジダ菌を静脈注射したマウス個体を調べた結果、肝臓における活性酸素とTG2核局在の誘導が認められました。

以上の結果により、病原性真菌であるカンジダ菌は、活性酸素、特にヒドロキシルラジカルを産生し、その作用によって肝細胞内においてTG2の核局在を引き起こし、その結果として、転写因子Sp1の架橋不活性化を介する肝細胞死を引き起こすことを見いだしました（図5）。

活性酸素、特にヒドロキシルラジカルと反応して蛍光を発する試薬CM-H2DCFDAを用いて、各条件下で8時間培養した後の活性酸素の産生量の様子を調べた結果。ヒト肝細胞株Hc細胞のみでは活性酸素の産生はみられなかった（1）が、病原性のあるカンジダアルビカンス菌（2）やカンジダグラブラータ菌（3）と共培養すると、活性酸素の産生が観察された。カンジダ菌と同数の病原性のないパン酵母（出芽酵母）（4）もしくは、ヒドロキシルラジカル産生に関わるNOX遺伝子を破壊したカンジダグラブラータ菌（5）と共培養しても、そのような変化はみられなかった。

各条件下で8時間培養した後の培養液中のヒドロキシルラジカル量を、電子スピン共鳴によって半定量的に評価した結果。ヒト肝細胞株Hc細胞のみではヒドロキシルラジカルの産生はみられなかったが（左右）、カンジダアルビカンス菌（左）やカンジダグラブラータ菌（右）と共培養すると活性酸素の産生が観察された。カンジダ菌と同数のパン酵母（出芽酵母）（左）もしくは、活性酸素産生に関わるNOX遺伝子を破壊したカンジダグラブラータ菌（右）と共培養してもそのような変化はみられなかった。ヒドロキシルラジカルのスペクトル強度の比は、カンジダアルビカンス菌 10 : カンジダグラブラータ菌 3 : パン酵母菌 1であり、あるレベル以上のヒドロキシルラジカルが、肝細胞の核におけるトランスグルタミナーゼ活性誘導に働いていることが分かった。

カンジダ菌は、活性酸素、特にヒドロキシルラジカルを産生し、その作用によって肝細胞内においてトランスグルタミナーゼ（TG2）の発現と核局在を誘導し、その結果として、肝細胞の生存に必須の肝細胞増殖因子受容体c-Metの発現をつかさどる転写因子Sp1の架橋不活性化を介する肝細胞死を引き起こす。

今後の期待

今回の発見により、ASH/NASHの患者における肝障害が、病原性真菌の産生する活性酸素を介して増悪する新たな発症機構の存在が浮かび上がりました。活性酸素を抑制する薬剤の投与により肝細胞でのTG2の核移行を阻害するなど、TG2の核局在を標的とした肝障害を抑える新たな治療法の開発が期待できます。

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